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近期活动：
基于DNA测序技术对市售蚯蚓药材来源的调查与验证
葛晓光1姜潮1田娜1魏一聪2黄璐琪1袁媛1刘小凡3金燕1赵宇阳1
1. 中国中医科学院中药资源研究中心国家道地药材重点实验室，北京，1007002. 福建中医药大学药学院，福建福州，3501223. 中国人民大学统计学院，北京，100872
概括
概括
目的:探讨蚯蚓制品的产地,并开展中药研究,明确蚯蚓制品的品种,提高中药质量。
方法:随机采集安国、亳州等7个主要主流市场商品蚯蚓,进行DNA提取、COⅠ片段PCR扩增及核酸测序,并与建立的蚯蚓参考核酸数据库进行比对;对主流中药材进行调查整理。
结果：
1、我国商品蚯蚓主要来源于34个种，其中来自Amynthas aspergillum的占22%，来自Metaphire vulgaris的占22%，来自Pheretima sutchuenensis和Pheretima wilmii的占23%。
2、各市场主流商品蚯蚓品种差异很大，具有明显的地域特色；
3.本草研究结果表明，不同朝代本草书中蚯蚓的来源并非只限于一种，而是以具有“白颈”特征的蚯蚓入药，且不同朝代本草书及标准发生了许多变化。
结论：应建立合理有效的蚯蚓来源和质量控制方法。
【关键词】
地龙；市场调查；分子鉴定；COⅠ；草药研究
前言
前言
开展中药产品产地调查，是明确中药产地、确定真伪鉴别指标、完善中药质量标准的前提条件。
地龙是临床常用的一种动物药材，来源于蚯蚓科植物地龙、普通地龙、丘陵地龙或扇尾地龙的干燥体，均属于蚯蚓科植物。
前者俗称“广地龙”，后三者俗称“虎地龙”。
蚯蚓属于寡毛纲，我国该类种类极其丰富。截止2010年，陆生蚯蚓有9科、31属、328种（含亚种），目前还存在大量寡毛纲新种。目前商品蚯蚓药材大多来源于野生。随着产地面积的增加，各地的寡毛纲种类都有可能被采收，使得商品蚯蚓的来源极其复杂，亟待明确。
前期药源调查发现，商业用蚯蚓包括P. caliginosa、P. common、P. William、P. caliginosa、Allolobophora caliginosa trapezoides Ant. Duges、P. robusta (E. Perrier)、P. tschiliensis (Michaelsen)、P. californica (Kinberg, 1867)、P. magna (Chen, 1938)等13个种，该地区常用的蚯蚓种类达3科4属49种。
由于不同产地的蚯蚓品种形态相似，其内脏形态、雄孔、交配腔等主要识别特征常在加工过程中遭到破坏，体色、表面纹理特征常在干燥过程中消失或改变，导致蚯蚓制品产地判定困难。
近年来随着分子系统学和生物信息学的发展，包括寡毛类在内的动植物核酸数据库逐渐建立。本研究以历史本草、地方志、药典为依据，对药用蚯蚓的种类来源进行判定，通过细胞色素c氧化酶I基因（COⅠ）序列分析结合形态学分类对采集的232批市售蚯蚓进行来源调查，为蚯蚓真伪鉴别提供依据。
本草研究
草药研究
1.1 姓名验证
蚯蚓名称的由来在历代本草书中都是比较清楚的。
蚯蚓原名地龙，最早作为药物使用于东汉时期的《神农本草经》中记载：“蚯蚓能治蛇瘤，去三虫、尸、鬼、毒，杀长虫，化为水。”
地龙之名，源于“土龙”（南北朝陶弘景《名医录》：“白颈蚯蚓，又名地龙，三月采制，阴干”），晚唐至五代时称为“地龙子”（唐梅彪《食药尔雅》：“蚯蚓屎：又名龙通散，一称蚯蚓田土，一称地龙散，一称韩仙鱼，一称地龙屎”；五代孟观《药典》：“蚯蚓亦可单用，有小毒，晒干者煮为粉，治蛇咬伤。又名地龙子”），宋代开始以“地龙”之名入药（王怀隐《本草纲目》：“地龙子，亦名地龙子”，今属药用）。 《太平圣惠方》：“地龙十条，炙干，上等捣为末，晚间睡前以冷茶饮二钱，即服。”；王继贤等《绍兴本草》：“白颈蚯蚓，俗称地龙。非唯白颈者，实同也。”)。
历代本草仍沿用“蚯蚓”或“白颈蚯蚓”等名称，直到1963年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》），将“蚯蚓”明确为蚯蚓的药用名，并正式成为法定名称。
1.2 品种审定
历代本草均将具有“白颈”特征的蚯蚓视为主流药用品种，但药用品种并非仅出自一个物种（表1）。宋代，有医家在《土经本草》和《正类本草》中开始将“白颈蚯蚓”与“蚯蚓”区分开来，并附上“蜀州白颈蚯蚓”的药用图，认为其“功用与蚯蚓相同”。
明代李时珍《本草纲目》中，“蚯蚓”与“白颈蚯蚓”为不同条目，而清代王绩《药材集要》中明确记载：“蚯蚓又名寒蚓、蚯蚓。色红而气味芳香者可用，色黑而易碎如泥者不可用。颈白者另种，气味清新芳香，治热病尤佳。”这说明人们早就认识到蚯蚓药材的原动物不止一种，有种类的差异。
除了“白颈蚯蚓”外，古代本草书中也有对“紫颈蚯蚓”的用途的记载。
宋代陈子明在《妇女全方》中写道：“若患产后癫痫，挖出活紫颈地龙一条为药。待地龙滚动三圈，取出别用。莫让药出去，只欲得地龙身上的唾液”；宋代王彦远在《石斋选方》中写道：“恶血邪气入心，如见鬼，而致癫痫。用朱砂一二钱，研末飞扬，以婴儿乳汁三四匙润之，以紫颈地龙一条为药滚动三圈，刮净，去地龙别用。加无灰酒一杯，分三四剂服下”； 王肯堂《政治准绳》、薛俪《薛氏医案》、孙一奎《赤水原注》等书中亦有此类用法，但其临床治疗产后癫痫的用处与现今的地龙不同，用法亦有差异。
综上所述，中国蚯蚓历来以“白颈蚯蚓”为中国药用主要来源，但由于历代本草图谱不准确，难以反映准确种类信息，需结合其他信息进行考证。明清以前，药用蚯蚓的来源尚无明确概念，多数本草著作认为其遍布各地（表1）。
查阅清明时期的地方志，今北京、河北、辽宁、山东、江苏、浙江、江西、广东、海南等地所产蚯蚓均有入药的记载（表2），无明显地域和品种偏好，无法考证具体的入药品种。
民国以后，广东蚯蚓逐渐被大家所认识。陈仁山《药材产地辨》载：“以广东顺德陈村、下滘所产蚯蚓为最佳。”其原因可能是广东所产的品种，如人参形远盲蚯蚓、保宁腔蚯蚓等，体型较大，环纹明显，更符合古人“药材当大而颈白，老而有力”的观点。
表 1 历代本草书中对蚯蚓的记载
注：-表示该条目内容未收录。
表2 地方志中关于蚯蚓药用的记载
市场调查
市场调查
2.1 材料
2.1.1 样本
蚯蚓药材及碎块采自河北安国、安徽亳州、四川荷花池、广西玉林、广东清平、广东普宁、山东顺王城等地的中药材市场，共计采集样品232个，经上海交通大学邱江平教授进行形态学初步鉴定，并结合DNA测序结果进一步验证。
蚯蚓参考药材购自中国食品药品检验研究院，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。另外，20种蚯蚓原动物参考样品由西南大学刘斌教授课题组提供，60种蚯蚓原动物样品由上海交通大学邱江平教授课题组提供。
2.1.2 试剂
蛋白酶K(德国Merck公司，批号：1245680100)；Speed STAR HS Tag DNA聚合酶(大连Takara公司，批号：RR070A)；2000bp DNA Markar(大连Takara公司，批号：D501A)；DNeasy Blood&Tissue DNA提取试剂盒(上海Qiagen公司，批号：69506)；溴化乙锭试剂(美国Fluka公司，批号：E8751AG)。
2.1.3 仪器
MM400混合研磨机(德国Retsch公司)；1×1196孔梯度PCR扩增仪(美国Applied Biosystem公司)；SYNGENE凝胶成像系统(香港GENE公司)；Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪(美国Themia Fishar公司)。
2.2 方法
2.2.1 DNA提取
除去样本上的泥土，用70%乙醇擦拭表面，风干。用球磨机研磨，取约50mg粉末，放入干净的2mL离心管中，液氮速冻，再用球磨机研磨成粉末。按照DNeasy血液及组织DNA提取试剂盒说明书提取总DNA，用Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪测定其浓度，用于PCR反应或-20℃保存备用。
2.2.2 PCR扩增及电泳检测
将提取的 DNA 用于 PCR 扩增，使用 COI 通用引物 LCO1490: 5JGGT CAA CAA ATCATA AAG ATA TTG G-3' 和 HCO2198: 5Z-TTA ACTTCA GGG TGA CCA AAA AAT CAT'。
PCR反应体系为25 μL，包括无菌双蒸水19 μL，10×FBI缓冲液2.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1.5 μL，LCO1490和HCO2198引物各0.25 μL（10 mmol·L-1），SpeedSTARHSTaqDNA聚合酶0.3 μL（5 U·μL-1），DNA模板1 μL。COI序列扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃最后延伸5 min。 扩增结束后取5 μL PCR产物，加入5 μL 6xLoading Buffer，经溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳，用SYNGENE凝胶成像系统进行观察。
2.2.3 测序和数据处理
将阳性扩增产物纯化后与相应引物进行双向测序，测序由瑞博星科生物技术有限公司完成。
使用BioEdit 7.2.6软件对测序峰及序列进行校对，去除引物序列并进行拼接，得到相应的质量合格的DNA序列，将数据与NCBI数据库（）和Protozoa Database（上海交通大学建立）进行BLAST比对，得到最相似的物种信息。
利用MEGA6.0对获得的单倍型序列进行分析，基于Kimuro-2参数模型计算遗传距离，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，采用Bootstrap检验方法检验各分支的支持率，Bootstrap值设置为1 000个重复。
2.3 结果与分析
2.3.1 商品蚯蚓形态分析
商业蚯蚓可根据大小、颜色和质地明确分为四类（图1）
1）海南龙（海南龙、海南山龙），体长30厘米以上，背部呈棕黑色至紫黑色，有粗糙的鬃毛；
2）广西土龙（广西土龙、广地龙），体长20至30厘米，背部黄褐色至深褐色；
3）体长20厘米以下、背部黄色至褐色、质地较软的上海土龙（上海土龙、河南土龙、山东土龙、小土龙）；
4）进口蚯蚓（泰国蚯蚓、越南蚯蚓）体长20～30厘米，盘状，颜色为红褐色。
同一种类的蚯蚓由于加工方法不同，其体表颜色存在差异，环纹位置、形状清晰，部分样品可见背孔或雄孔，但多数样品缺乏准确的形态学鉴别特征。
为了确定市售药材的来源，本研究对所有样品的COI片段进行了扩增、测序和比对。
图1：商品蚯蚓的形状
2.3.2 COⅠ序列分析及基因鉴定
利用该试剂盒提取的蚯蚓样品总DNA质量浓度一般为30～220ng・mL-1。
使用LCO1490/HCO2198引物对232批样品进行扩增成功率为100%（图2）。
图2 部分蚯蚓药材COI引物扩增凝胶电泳结果
对PCR扩增产物进行测序，有2批样品的扩增产物测序失败，共计230批样品获得COⅠ序列，去除引物区域后长度为658 bp。
将获得的230个COⅠ序列与NCBI数据库及原始动物数据库进行BLAST比对。
类似的蚯蚓共有34种，其中药典产品4种：
曲霉，M. vulgaris，M. guillelmi，A. pectiniferus；
以及中国药典未收录的30种：
A.amis、A.carnosus、A.corticis、A.endophilus、A.fuscatus、A.gracilis、A.hainanicus、A.incongruus、A.morrsi、A.octopapillatus、A.papulosus、A.robustus、A.triastriatus、A.zhangi、Duplodicodrilus schmardae、Eisenia andrei、M. californica、 glareosa、M. magna、M. sieboldi、M. tschiliensis、A. arenulus、A. emarcidus、A. jiriensis、A. litellus、A.phaselus、A. stricosus、M. bahli、M. birmanica。
2.3.3商品蚯蚓基地市场调研
结合商品蚯蚓检测结果，从不同商品类别/不同产地、不同市场三个维度成功获取230批次COⅠ序列样品，用于市场调研分析（图3）。
图3 市售蚯蚓样品COI序列物种分析
注：紫色框来自榆林；绿色三角形来自安国；卡其色菱形来自亳州；灰色三角形来自山东顺王城；红色圆圈来自广州清平；黄色框来自四川莲花池；蓝色框来自广东普宁。
结果表明：
1. 采集到的样品中，原种为曲霉菌（Pheretima aspergillus）的占22%，普通毛地龙（Pheretima vulgaris）的占22%，毛地龙属（Pheretima genus）和威廉毛地龙（Pheretima william）的含量极少（<1%）。
2.市场上销售的蚯蚓有55%并非来源于2015版中国药典规定的产地，而主要来源于M. magna。
3、河北安国、安徽亳州、广西玉林是我国地龙交易的主要地点，广东清平、广东普宁、四川荷花池、山东顺王城等地交易量较少。
4、各市场交易的主流品种差异较大，安国药材市场蚯蚓产品以广西蚯蚓、海南蚯蚓为主，产地主要为癣蚓、保宁蚯蚓；安徽亳州蚯蚓以上海蚯蚓、海南蚯蚓为主，产地主要为癣蚓、保宁蚯蚓；广西林、四川荷花池以广西蚯蚓、广西蚯蚓为主，产地主要为癣蚓。
BLAST比对结果及基于COⅠ的系统发育树显示，商品蚯蚓来源于34个物种，每种商品蚯蚓都有相对固定的物种来源。其中，海南蚯蚓和海南山蚯蚓主要来源于保宁蚯蚓，广西蚯蚓主要来源于环纹地龙和保宁蚯蚓，上海蚯蚓主要来源于环纹地龙。河南、山东、江苏的蚯蚓虽然来自不同地方，但其来源均以环纹地龙为主。
讨论
讨论
3.1 市售蚯蚓基复合物
我国药材市场上销售的蚯蚓来源十分复杂，本次研究共对230批次样品成功测序，通过DNA序列分析检测出34个不同的种类。
此前陈等利用形态学对我国蚯蚓的药源及商品性进行调查，认为蚯蚓有13个原始种，其中90%以上为地道蚯蚓，其余主要为暗背异头蚯蚓、湖北蚯蚓、冰乾蚯蚓等。
但本次研究发现，市售蚯蚓55%为非药典物品，主要种类为保宁蚯蚓，并未发现暗背异头蚯蚓、前环蚯蚓等起源种。
郭利晓等利用微量性状鉴别蚯蚓来源，采集了3个市场13批次样品，发现混装、假冒商品的来源包括保宁蚯蚓、志利蚯蚓、庄尾蚯蚓、加州蚯蚓等；孙杰等利用形态学鉴定和DNA测序发现广蚯蚓主要来自人参环蚯蚓、保宁蚯蚓和暗洞蚯蚓3个品种。该研究发现，除了这些来源外，市售蚯蚓还包括褐蚯蚓A.fuscatus、优雅蚯蚓A.gracilis等30余种，说明市售蚯蚓的来源十分混乱，需要进一步明确。
3.2 历史上使用的药用蚯蚓并非同一种类
我国历代主流医家均以“白颈蚯蚓”入药，“白颈蚯蚓”并非特定的属或种，而是一种体型较大，有白色或灰白色环带，且膨大明显的蚯蚓种。
从地域上看，历代本草书大多认为蚯蚓是“土生土长的”、“随处可见的”，在历代地方志中，北至辽宁沈阳，南至海南琼山，西至四川成都，东至江苏扬州等地均有使用蚯蚓入药的记载。
从本草插图看，药用蚯蚓颜色多样，均有明显的环纹，符合伞形蚓科近缘蚓属的特征，但均缺乏种鉴别特征，无法确定为具体的药用种。
民国至建国时期，广东蚯蚓逐渐被人们认识。陈仁山《药产鉴别》中明确指出“以广东顺德陈村、下滘所产蚯蚓为佳”。同时，陈存仁认为药用蚯蚓来自“Perichaeta sieboldii或Lumbricus terrestris”。但他的《中药标本图鉴》中蚯蚓体环清晰，且肿胀（图4A、B），与P. aspergillum或P. aspergillum的形态特征（4C）较为相似。
图4 本草纲目中蚯蚓的图片
《南京药学院药学学报》援引陈存仁《中国药理大辞典》的观点，进行了药源考察，认为蚯蚓来源于“蚯蚓科的Perichaeta sieboldii或Lumbricus terrestris，蚯蚓科的Pheretima asiatica等动物”，同时认为“蚯蚓的干燥药材约有Pheretima pingi和P. aspergillum两种”。
后来《中药志》采纳了《衍史》和《中国药学大辞典》的一些观点，认为蚯蚓起源于Pheretima asiatica或蚯蚓，但却错误地将《中国药学大辞典》中Pheretima asiatica的拉丁学名定义为Pheretima asiatica。其实，Pheretima asiatica是Metaphire tschiliensis的同义词，而非Pheretima aspergillum。
后来1963年版《中国药典》沿袭了《中药志》的做法，认为蚯蚓起源于亚洲地龙或蚯蚓，也将亚洲地龙定义为Pheretima asiatica。
1977年版中国药典对此进行了修订，认为蚯蚓起源于Pheretima aspergillum或蚯蚓，并赋予了拉丁名Pheretima aspergillum。
1995年版《中国药典》取消了条纹蚯蚓的药用标准，同时采用《上海市中药标准》的做法，纳入了“上海蚯蚓”，规定广蚯蚓的原始基数为人参环纹蚯蚓，上海蚯蚓的原始基数为普通环纹蚯蚓、威廉环纹蚯蚓或梳盲环纹蚯蚓，并一直沿用至今。
《中国本草》认为，蚯蚓Allolobophora caliginosa (Savigny) trapezoides的原始来源在河南中牟、山东凉山、山西等地。但蚯蚓Allolobophora caliginosa是梯形蚯蚓Aporrectodea trapezoides的异名，后者是新疆、河北、北京等地的优势种，其环带不明显，呈半环状，形态上并非“白颈蚯蚓”。普通环蚯蚓Pheretima vulgaris是河南中牟、山东凉山等地的优势蚯蚓，河南、山东等地采集的蚯蚓药材经鉴定为普通环蚯蚓Pheretima vulgaris。地方志（《山东通志》、《莒州志》）也有记载蚯蚓入药。 1995年中国药典取消了蚯蚓的用药标准，增加普通环纹蚯蚓更为合理。
3.3 中国药典的来源与质量控制探讨
从研究结果可以看出，历代药用蚯蚓并非单一种类，而是对所有具有“白颈蚯蚓”特征的蚯蚓的统称，且对其形态特征缺乏准确的描述。
首先，药用蚯蚓北至辽宁沈阳，南至海南琼山，西至四川成都，东至江苏扬州，各地均有产，但《中国药典》收录的四种蚯蚓，产地分布并不多。
其次，自清末以来，部分本草引入拉丁学名，原有的拉丁学名也不断发生变化，包括Perichaeta sieboldii、Lumbricus terrestri、Pheretima aspergillum、Pheretima asiatica、Pheretima pingi、Allolobophora caliginosa等均有入药记载，导致药用植物来源难以确定。
此外，历版《中国药典》收录的蚯蚓来源范围从Pheretima osiatica、Allolobophora caliginosa trapzoides，到Pheretima aspergillum、Allolobophora caliginosa trapzoides，再到Pheretima a aspergillum、P. vulgaris、P. guillelmi、P. pectinifera，历经多次修订，尤其是收录了无“白颈”的暗背蚯蚓A. caliginosa trapzoides，说明中医药界对其来源可能难以达成共识，其来源认定可能既涉及本草研究，也涉及资源储备和质量控制的考虑。
特别地，本研究结果表明，目前我国市场上出售的蚯蚓至少来自34个物种。随着传统生产资源的萎缩、蚯蚓产地的扩大以及新蚯蚓物种的不断发现，未来市场上出售的蚯蚓的来源可能还会进一步增多。目前的性状、微观和理化方法还无法准确判定市场上出售的蚯蚓的物种来源，未来蚯蚓来源的鉴别将变得更加困难。
为进一步防治，可考虑引入DNA分子鉴定等精准识别手段，加大蚯蚓养殖力度，逐步引导药用蚯蚓向地龙等传统药用品种靠拢，从资源和检测两个角度解决蚯蚓品种混乱的问题。
参考文献（略）
药府中医药农业信息交流群
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来源：葛晓光,姜超,田娜,等.基于DNA测序技术对市售蚯蚓药材来源的调查与验证[J].现代中药,2019,21(9):1206-1214。
